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大鼠組織因子途徑抑制物-2（TFPI-2） ELISA 檢測試劑說明書

更新時間：2010-11-16 | 點擊率：2681

詳細(xì)介紹：

大鼠（Rat）組織因子途徑抑制物-2（TFPI-2） ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用標(biāo)本：血清或血漿

試驗原理：
TFPI-2試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知TFPI-2濃度的標(biāo)準(zhǔn)品

、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測

。先將TFPI-2和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后

，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌

，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物

，然后加入底物A、B

，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色

。顏色的深淺和樣品中TFPI-2的濃度呈比例關(guān)系

。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置配制
96/48人份酶標(biāo)板 1塊板（96T）半塊板（48T）即用型
塑料膜板蓋 1塊半塊即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：400pmol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml）按說明書進(jìn)行稀稀
空白對照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml）即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml）即用型
生物素標(biāo)記的抗TFPI-2抗體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml）即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml）即用型
洗滌緩沖液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml）按說明書進(jìn)行稀釋
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型
終止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型

自備材料
1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul

、10ul

、50ul、100ul

、200ul

、500ul、1000ul

。
3．振蕩器及磁力攪拌器等

。

安全性
1．避免直接接觸終止液和底物A、B

。一旦接觸到這些液體

，請盡快用水沖洗。
2．實驗中不要吃喝

、抽煙或使用化妝品

。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存

，使用前恢復(fù)到室溫

。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存

。
2．實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中

，密封保存，以免變質(zhì)

。
3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好

。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用

。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染

，吸取終止液和底物A、B液時

，避免使用帶金屬部分的加樣器

。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液

。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干

，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水

。
7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子

。底物B對光敏感

，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸

，有毒

。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應(yīng)一致

，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣

。
9．按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作

。

樣品收集

、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激

。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管

。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離

。
2

、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽

、肝素血漿可用于檢測

。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3

、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物

。
4、保存------如果樣品不立即使用

，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存

，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血

。如果血清中大量顆粒

，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍

。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍

。

試劑的準(zhǔn)備
1．標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存

。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻

。稀釋比例按下表中進(jìn)行：
400 pmol/L （6號標(biāo)準(zhǔn)品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

。
200 pmol/L （5號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100 pmol/L （4號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 pmol/L （3號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 pmol/L （2號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5 pmol/L （1號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 pmol/L （空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋

。

操作步驟
1．使用前

，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫

，以免加樣時加入大量的氣泡

，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)

。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔

。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔

。
3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)

。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體

。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻

，37℃溫育1小時

。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液

，振蕩30秒

，甩去洗滌液，用吸水紙拍干

。重復(fù)此操作3次

。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次

。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP

，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘

。
6．甩去孔內(nèi)液體

，每孔加滿洗滌液

，振蕩30秒

，甩去洗滌液，用吸水紙拍干

。重復(fù)此操作3次

。如果用洗板機(jī)洗滌

，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A

、B各50ul

，輕輕振蕩混勻

，37℃溫育10分鐘。避免光照

。
8．取出酶標(biāo)板

，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果

。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值

。

建議使用的實驗方案
標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pmol/L）
A 400 400 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
B 200 200 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
C 100 100 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
D 50 50 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
E 25 25 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
F 12.5 12.5 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
G 0 0 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
H 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果

。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品

。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990

。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)

。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%

。

結(jié) 果判斷與分析
1

、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y）

，相應(yīng)的TFPI-2標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）

，做得相應(yīng)的曲線，樣品的TFPI-2含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度