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大鼠內(nèi)皮素-1（ET-1） ELISA 檢測試劑盒說明書

更新時間：2010-11-16 | 點擊率：3153

詳細(xì)介紹：

本試劑僅供研究使用標(biāo)本：血清或血漿

試驗原理：
ET-1試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知ET-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)品

、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測

。先將ET-1和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后

，加入親和素標(biāo)記過的HRP

。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物

，然后加入底物A

、B，和酶結(jié)合物同時作用

。產(chǎn)生顏色

。顏色的深淺和樣品中ET-1的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置配制
96/48人份酶標(biāo)板 1塊板（96T）半塊板（48T）即用型
塑料膜板蓋 1塊半塊即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：80pg/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml）按說明書進(jìn)行稀稀
空白對照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml）即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml）即用型
生物素標(biāo)記的抗ET-1抗體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml）即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml）即用型
洗滌緩沖液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml）按說明書進(jìn)行稀釋
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型
終止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型

自備材料
1．蒸餾水

。
2．加樣器：5ul

、10ul、50ul

、100ul

、200、500ul

、1000ul

。
3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
1．避免直接接觸終止液和底物A

、B

。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗

。
2．實驗中不要吃喝

、抽煙或使用化妝品。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份

。

操作注意事項
1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存

，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄

，不可保存

。
2．實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存

，以免變質(zhì)

。
3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用

。保質(zhì)前使用

。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A

、B液時

，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液

。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品

。
6．洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水

。
7．底物A應(yīng)揮發(fā)

，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感

，避免長時間暴露于光下

。避免用手接觸，有毒

。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值

。
8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣

。
9．按照說明書中標(biāo)明的時間

、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

樣品收集

、處理及保存方法
1

、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管

。收集血液后

，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2

、血漿-----EDTA

、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測

。1000×g離心30分鐘去除顆粒

。
3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物

。
4

、保存------如果樣品不立即使用

，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍

。盡可能的不要使用溶血或高血脂血

。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾

。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍

。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備
1．標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備

，不能儲存

。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：
80 pg/ml （6號標(biāo)準(zhǔn)品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

。
40 pg/ml （5號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
20 pg/ml （4號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
10 pg/ml （3號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
5.0 pg/ml （2號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.5 pg/ml （1號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 pg/ml （空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul

。

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
1．使用前

，將所有試劑充分混勻

。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡

，產(chǎn)生加樣上的誤差

。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔

。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定

，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔

、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)

。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板

，輕輕振蕩混勻

，37℃溫育1小時。
4．甩去孔內(nèi)液體

，每孔加滿洗滌液

，振蕩30秒，甩去洗滌液

，用吸水紙拍干

。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌

，洗滌次數(shù)增加一次

。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻

，37℃溫育30分鐘

。
6．甩去孔內(nèi)液體

，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒

，甩去洗滌液

，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次

。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次

。
7．每孔加入底物A

、B各50ul，輕輕振蕩混勻

，37℃溫育10分鐘

。避免光照。
8．取出酶標(biāo)板

，迅速加入50ul終止液

，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值

。

建議使用的實驗方案
標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/ml）
A 80 80 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
B 40 40 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
C 20 20 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
D 10 10 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
E 5.0 5.0 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
F 2.5 2.5 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
G 0 0 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
H 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的

，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品

。稀釋度的線性

。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)

。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)

、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié) 果判斷與分析
1

、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的ET-1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）

，做得相應(yīng)的曲線

，樣品的ET-1含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。